scRNA-seq 技术介绍

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单细胞转录组测序技术汇总

Smart-seq2 （2013）

Smart-seq2 的流程如下图所示：
Smart-seq2

  1. 细胞裂解。使用相对较温和的方式（低渗溶液）裂解细胞。裂解液中包含了 free dNTPs 和具有 oligo-dT 的寡核苷酸序列（包含30nt的 oligo-dT 和25nt的通用5’锚定序列），后者能够起始具有 polyA 尾的 RNA 的 RT 反应。free dNTPs 能够提高 RT-PCR 的产量。
  2. RT。当 RT 进行至 RNA 5’端时（合成是从5’-3’，对 RNA 模版而言是从其3’-5’），会在合成的 cDNA 3’ 末端添加2-5个 untemplated nucleotides，而模版转换反应（template-switching reaction）正依赖于这几个碱基。TSO（template-switching oligos）3’末端会携带与这几个碱基互补的序列，以及与 oligo-dT 引物相同的锚定序列（使得后面的 PCR 只需要使用单种引物），与RNA 5’端连接，然后反转录酶实现模版转换，在 cDNA 3’端合成与 TSO 互补的序列。
  3. 预扩增。当合成第一条链后，进行有限次数的循环，得到的材料足够进行后续分析即可。
  4. Tagmentation。对扩增的 cDNA 快速高效地构建测序文库，DNA 片段化和接头连接在同一步完成，使用 Illumina 双接头策略。
  5. 扩增并测序。对带接头的 DNA 进行扩增并测序。

与 SMART-seq 的差异：

  1. SMART-seq 是在42度下进行RT，但由于部分 RNA 具有二级结构，出现位阻现象，导致链的延伸提前终止。SMART-seq2 中加入了甜菜碱，是一种甲基供体，能够增加蛋白质热稳定性。SMART-seq2 先在50度下反应2 min，破坏 RNA 二级结构，然后回到42度，进行2 min RT，循环多次，提高cDNA产量
  2. 甜菜碱的加入需要提升氯化镁浓度。镁离子能与甜菜碱中的羧酸阴离子结合，作为缓冲液帮助细胞应对渗透压的变化。有报道称过量氯化镁可能对 PCR 保真性有负作用，但在 SMART-seq2 的 RT-PCR 以及 PCR 阶段并未发现
  3. SMART-seq 使用的 TSO 3’端是3个 riboguanosines，并使用 Moloney murine leukemia (M-MLV) 逆转录酶，后者能够进行模版转换，合成 TSO 互补链；SMART-seq2 中前两个碱基还是 riboguanosines，第3个是修饰过的鸟嘌呤得到的 locked nucleic acids (LNA)。LNA 单体具有更强的热稳定性，以及在退火阶段高效结合到cDNA非模版3’端。RT 酶则换成了 Superscript II (Invitrogen)，它是 M-MLV 编辑得到的，Rnase H 酶活性降低，热稳定性增强
  4. SMART-seq2 预扩增时用 KAPA HiFi HotStart ReadyMix 替换了 Advantage 2 polymerase mix，取消了先用磁珠富集 cDNA 这一步，简化了 protocol

CEL-seq （2012）

CEL-seq 通过体外扩增（In vitro transcription, IVT）实现单细胞测序。
CEL-seq

  1. RT。引物中包含 poly(T)，barcode，5’ Illumina 测序接头和 T7 启动子，结合到具有 ploy(A) 尾的 mRNA 上，合成 cDNA。
  2. 合成第二条链后，形成的就是双链的 DNA。将所有的 cDNA 样本混合到一起，达到足以进行 IVT 的模版量。T7 promoter 用于启动IVT，以第二条合成的 DNA 为模版转录 RNA（所以此时的 RNA 序列与原 mRNA 序列是反向互补的，即 antisense RNA，aRNA），此时5’端最外为 Illumina 5’adaptor。经过多轮 IVT，实现模版的线性扩增
  3. 扩增后的 RNA 直接进入 RNA 模版准备步骤，被打断适合测序的大小，连接上 Illumina 3’ adaptor
  4. RNA 反转录成 DNA。两端都具有接头，且含有 barcode 的片段被用于双端测序。read1 记录 barcode 信息，read2 用于确定 RNA

CEL-seq2 （2016）

CEL-seq2

相较 CEL-seq，做出了一些改进：

  1. RT 引物中加入了一段6nt的 UMI，将8nt 的 barcode 缩短至6nt，并缩短 T7 引物和 Illumina 5’ 接头，使引物总长从92nt缩短至82nt，提升了 RT 效率
  2. RT 时使用 SuperScript II，并在第二条链合成时使用 SuperScript II Double-Stranded cDNA Synthesis Kit
  3. 改进了去除 dsDNA 和 aRNA 的过程，提高产量
  4. IVT 得到的 RNA 在反转录时，直接插入接头，不需要进行连接

Drop-seq（2015）

首先是构造大量不同的 barcoded beads，示意图如下：
Drop-seq-barcode

直接在每个 beads 上从5’-3’合成寡核苷酸引物，3’用于启动逆转录。每条寡核苷酸链包含4个部分：

  1. PCR handle，一段共有的序列，作为 PCR 和测序的起始位置；
  2. 细胞标签，用于标记细胞身份，同一 bead 中均相同；
  3. UMI，用于排除 PCR 偏好性带来的干扰
  4. oligo-dT 序列，捕获带有 poly(A) 尾的 mRNA，起始 RT

barcode 的合成采用 split-and-pool 策略，将上百万个磁珠分装成4等份，分别加入A，G，C，T，然后全部混合，再随机封装，共计循环12次，得到足够多的不同barcode；之后整个微珠池进行8轮的简并寡核苷酸（degenerate oligonucleotide）合成，得到 UMI

然后让我们来看一下后续的整个分析过程示意图：
Drop-seq

  1. 设备中两条通道分别导入含有微珠的细胞裂解液和细胞悬液，穿过油通道，形成微滴
  2. 在微滴中裂解细胞，mRNA 结合到磁珠上，形成 STAMPs (single-cell transcriptomes attached to microparticles)
  3. 加入试剂破坏水油表面，使得微滴破坏，所有的 STAMPs 混合到一起，进行 RT（使用的是模版转换来获取全长 cDNA），生成共价结合，稳定的 STAMPs（cDNA 已经与磁珠上的引物连接在一起了）
  4. 之后就对 cDNA 进行 PCR 扩增，然后进行测序

inDrop-seq（2015）

首先来看 barcoded hydrogel microspheres（BHM，带条形码的水凝胶微球） 的合成过程，示意图如下：
inDrop-seq-BHM
inDrop-seq-barcode

其中看上图B中的结构，acrylic phosphoroamidite moiety 是常用的 DNA 引物，后面是一段可光解的间区和 T7 RNA 聚合酶启动子序列，以及测序引物。之后，经过两部的引物扩展（图D，*代表反向互补序列）：先进行引物延伸，加上了 barcode1 和 W1 site，然后转换成单链 DNA，再进行一次杂交和延伸，加上 barcode2，UMI 和 poly(T)

再来看整一个测序的过程：
inDrop-seq

  1. 在微流设备中有4个输入通道，分别是 BHMs，细胞，RT/lysis 试剂以及油，封装成微滴
  2. 利用 UV 释放 BHMs 上的引物，与裂解细胞得到的 mRNA 结合，进行 RT
  3. 破坏微滴后将所有 cDNA 整合，按照 CEL-seq protocol 进行测序

CITE-seq （2012）

Cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing (CITE-seq) 利用寡核苷酸标记的抗体，对细胞表面蛋白和和转录组同时进行测定，其流程如下图所示：
CITE-seq

  1. 如图a所示构造 DNA-barcoded antibodies。通过链霉亲和素-生物素互作，将寡核苷酸5’端与抗体相连，而这种通过二硫键的结合会在还原条件下断裂，释放寡核苷酸（图b所示）。寡核苷酸中包括用于 PCR 扩增的 handle，用于抗体身份识别的 barcode，以及能与 oligo-dT 引物结合的一段 polyA 序列。
  2. 将 antibody-oligo 复合物与单细胞悬液共孵育，条件设置参照流式细胞染色，之后将未结合的抗体移除，然后进行 scRNA-seq。
  3. 以 Drop-seq 为例（beads 构成如图c所示），在微流体设备中将单细胞封装成小液滴，然后细胞裂解，使得带有 oligo-dT 的 beads 与细胞 mRNA 及抗体-寡核苷酸复合物结合，然后对同一细胞的 mRNA 和寡核苷酸进行 RT 和 PCR（图d），并标记上相同的 cell barcode。
  4. 扩增得到的 cDNA 和 antibody-derived tags (ADTs) 可以通过大小进行区分，从而分别进行 Illumina 测序文库的制备。由于两种文库可以独立生成，因此可以调整其在单个 lane 中的比例以确保各自所需的测序深度。

REAP-seq

RNA expression and protein sequencing assay (REAP-seq) 实现了在单个细胞中同时测定蛋白质和 mRNA。细胞通过连接了 DNA barcode 的抗体进行标记，其中抗体 DNA 标签的设计示意图如下所示：
REAP_AbB

可以看到抗体与长为65-66bp的寡核苷酸偶联。寡核苷酸包含3个部分：（1）33 bp Nextera Read 1 sequence，作为后续扩增和测序的引物；（2）8bp长的独一无二的抗体标签（antibody barcode, Ab BC）；（3）24-25 bp poly(dA) sequence。
REAP-seq 测序流程如下所示：
REAP_seq

  1. 将 antibody DNA label 与细胞共孵育，之后洗脱未连接的 AbBs。
  2. 如图a所示，将标记了抗体-DNA 标签的细胞用 10x Genomics single-cell (sc)RNA-seq platform 进行处理。通过 DNA 聚合酶实现同时扩增 AbBs 和 mRNA，并利用核酸外切酶Ⅰ将过量的未结合的单链寡核苷酸消化，防止不同细胞间的 barcode 与 AbBs 结合。
  3. 破坏液滴后通过大小对 AbBs 和 mRNA 进行分选，然后制备文库和测序。

REAP-seq 与 CITE-seq 的差异在于前者在抗体和胺化了的 DNA barcode 之间构建了稳定的共价键，能够减小空间位阻。减小空间位阻对于蛋白试验的扩展性至关重要，将来也能拓展至细胞内标记。

各步骤实现的方法

总的而言，scRNA-seq 相较 bulk 要解决的主要是以下两个问题：（1）单细胞的分离；（2）RT 以及（3）cDNA 的预扩增
首先来看单细胞的分离：

  • 酶处理
  • 激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）从冷冻切片上切除细胞，低通量，劳动密集型，获得完全干净的细胞在技术上也有挑战性
  • 膜片钳（patch clamping）

然后是单细胞的分选和捕获，主要有三大类：

  • 微孔板（microwell）：通过微移液枪或者激光捕获将细胞分离至微孔中
    • 能与流式细胞仪结合，从而快速将单个细胞分选至微孔内，此外还能够通过荧光标记富集特定细胞群
    • 能够检查每个孔内是否存在以破坏的细胞或者 doublets
    • 相较于微流系统，microwell 对细胞的大小没有严格的限制
    • 主要缺点是它不能像微流方法一样将反应缩减至纳升级体积，从而导致每个细胞平均的试剂消耗较高
  • 微流体（microfludic）中的微室（microchamber）：Fluifigm C1 微流系统，通过 IFC 芯片一次性捕获800个细胞，并在微室中完成细胞裂解，RT 和扩增
    • 通量高于微孔板，且能获得高质量的表达谱
    • 只有约10%的细胞会被捕获，因此不适合用于处理原材料有限的情况
    • 有几种可选的细胞大小范围，要求细胞大小均一，对具有粘性或者非球形的细胞的捕获效率较低
    • 每个 IFC 芯片的价格较贵，但由于能将反应体积缩小至纳升级，减少了试剂的消耗
  • 微流体（microfludic）中的微滴（microdroplet)：将细胞包裹在纳升级的微滴中，以微滴为反应器构建文库
    • 能够捕获成千上万个细胞，将反应缩减至纳升甚至皮升级别，减少试剂消耗，适合大量细胞的分析
    • 10X genomics 公司的 Chromium 系统相较 Drop-seq，在每个细胞内能够检测到更多的基因，能对更多的输入细胞进行测定，且设置和操作更简便，缺点是耗材价格更高。Drop-seq 中，细胞和 bead 是以随机的形式混合到微滴中的，因此需要进行足够程度的稀释才能避免混入两个细胞或两个 bead。对于 Drop-seq，其目标是在没20个微滴中捕获1个细胞，每10个液滴捕获1个 bead。所以，该系统经历双重泊松分布，只有约5%的输入细胞会产出转录组数据。相反，Chromium 系统产生的每个微滴几乎都只有单个 bead，故只需经历单个泊松分布，结果是约50%的输入细胞能产出转录组数据，远高于 Drop-seq

之后是反转录过程中，有两种主要的方法：

  • poly(A) or ploy(C) tailing，在 cDNA 5’端加上通用接头以便后续的 PCR 扩增
  • template switching，能够获得全长转录本，减少由于 RT 提前终止导致的 3’ coverage bias

cDNA 的预扩增也有两种方法：

  • PCR，指数扩增，效率取决于序列，偏向 shorter and less G-C rich 的序列
  • in vitro transcription（IVT），线性扩增，省去了模版转换步骤，但最后还需要额外的一轮 RT，可能导致额外的 3’ coverage bias

各 protocol 之间的系统比较

  1. Ziegenhain et al （2017）对比了 CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq, SCRB-seq, Smart-seq 和 Smart-seq2 6种方法，发现：
    • scRNA-seq 达到每个细胞1000,000条 reads 就达到了合理的饱和测序深度，足够进行后续的比较分析
    • 敏感性方面，Smart-seq2 是这些方法中最敏感的，找到了最多的基因，且覆盖度最均一；之后是 Smart-seq/C1，CEL-seq2/C1，SCRBseq；最后是 Drop-seq 和 MARS-seq
    • 准确性方面，6种方法之间的差异不大，均足够给出较准确的表达量
    • 精确度方面，Smart-seq2 最佳，但是其受扩增偏好性的影响也要高于其他使用 UMI 的方法
    • 综合上述各角度，检测效力上，SCRB-seq 在一百万和五十万条 reads 时最有效，CEL-seq2/C1 在测序深度为25万条 reads 时最有效
      总体而言，Drop-seq 最适合大量细胞的低深度测序，SCRB-seq 和 MARS-seq 适合细胞较少时的情况

Spike-ins

Spike-ins 是一组外源 RNA，加入到细胞裂解产物中，与内源 RNA 一同进行后续的测序分析。每份 spike-ins 的数量是一样的，然后根据最终检测的表达量来量化技术性方差
Spike-ins 是目前量化技术噪音最好的手段，但在实际应用中也存在一些局限性：

  • Spike-in 长度相对人类 mRNA 平均值较短，考虑到大部分 scRNA-seq 技术存在3’ coverage bias，较短的外源 RNA 可能带来问题
  • Spike-in RNA 分子的 poly(A) 相较内源 mRNA 较短，且没有5’帽子结构，RT 效率可能存在差异
  • 内源 mRNA 可能存在二级结构或者结合蛋白，从而导致转换效率较低
  • Spike-in RNA 分子的 GC 含量与内源 mRNA 也存在差异，可能带来干扰

总体而言，ERCC spike-ins 的捕获效率相较内源 mRNA 较低，另外某些情况下，ERCC spike-ins 的技术性方差要高于内源基因

UMI

UMI (unique molecule identifier) 是一段核苷酸序列，在 RT 过程中添加到 cDNA 上，每个分子携带独一无二的 UMI，用于消除 PCR 偏好性带来的干扰，主要能够提升低测序深度时的效力

挑战

  • 每个细胞内原材料较少，因此现有的方法都需要进行 cDNA 的预扩增，但是扩增偏好性导致结果与实际细胞中的分布情况并非完全成比例。为了克服这一问题，目前大部分技术都会结合 UMI 技术
  • 从器官或者组织中分离出单细胞的过程可能会改变细胞的表达谱，例如有研究发现早期应答基因（early response genes）会在分离几分钟内迅速上调，所以在数据分析的过程中需要注意是否会干扰结果的判定。克服这一问题有以下几种方法：
    • 对细胞核进行 RNA 测序。该方法目前用于尸体解剖样本（胞质 RNA 丢失）和肌肉与神经元细胞（过大导致无法使用 Fluidigm C1 系统）的转录组分析。不过该方法的问题是只有约10-20%的细胞 RNA 存在于细胞核中，且大部分转录本未经过处理，还含有内含子。细胞核中的 RNA 能否代表细胞质中的 RNA 仍然存疑
    • 使用转录抑制剂。如通过添加 α- amanitin 抑制 RNA 聚合酶Ⅱ减少细胞分离过程中引入的人为干扰，但是细胞吸收 α- amanitin 较慢，且转录抑制剂不能阻碍 RNA turnover （RNA 降解）
    • 使用适应寒冷的蛋白水解酶进行分离，从而在低温下进行操作，尽可能保留转录表达谱
  • 另外就是细胞分离难易程度不同，细胞脆弱程度不同，所以最终的单细胞悬液很难完美地代表实际的细胞分布情况
  • 生物学噪音如基因表达的波动性，细胞周期状态等

REF

各 protocol 之间的系统比较