Introduction
人类肿瘤存在普遍的异质性，可以通过各种不同的机制产生：
- 基因组不稳定，随机产生的突变不断累积，导致遗传多样性，产生具有不同基因型的亚克隆
- 细胞分化，肿瘤干细胞模型中，肿瘤是通过一组类干细胞群体层级组织形成的，并经由自我更新和分化不断生长
- 肿瘤微环境，肿瘤不同区域的不同选择压力导致肿瘤内异质性
上述模型相互交错，通过不同细胞的不同遗传，表观遗传，转录，蛋白等功能特性，建立起具有多层次的异质性的复杂系统
但是，过去癌症的研究和治疗选择多是基于整个群体水平，因此极可能因以下原因导致失败：
- 变异并非是驱动肿瘤生长的重要突变，或者并未在驱动肿瘤的细胞群中表达
- 部分细胞群体可能存在另外的驱动或者耐药性突变
- 肿瘤生长，存活以及耐药性可能是在非遗传水平导致的
随着单细胞水平相关技术的不断发展，我们能够对单个肿瘤内成千上万的细胞进行探索：
- 首先是对肿瘤内异质性程度进行描述，包括不同的调控途径，从基因型到表型，以及细胞群体在肿瘤内的空间定位
- 然后是理解不同细胞群体对肿瘤形成的功能和作用，包括驱动肿瘤发生，发展，耐药等
- 最后是将新的发现向临床转换，如分析肿瘤成分用于诊断和治疗选择，鉴定治疗前就已存在的耐药性亚克隆等
本综述将对肿瘤研究相关实验设计中技术层面的注意事项，单细胞研究发现的肿瘤生物学新知识，以及未来单细胞应用进行讨论
肿瘤单细胞研究技术层面的注意事项
首先是对肿瘤的分离，得到能够充分代表完整肿瘤中情况的细胞悬液，包括细胞类型，比例以及表达谱：
- 基于微滴的方法适合大量细胞的分析，但通常测序深度低，仅对单端测序，无法用于检测 SNVs 或者选择性剪切，另外不适合罕见细胞如 CTCs 等的分析
- 细胞数量较少的样本适合通过流式细胞仪或显微操作进行分离，在微孔板上制备文库，测序深度深，且测定的全长转录本
- 保存过的样本或者不易分离的样本，进行 snRNA-seq
- 单细胞基因组学分析用于追踪克隆动态发展，推断进化轨迹，比较对应的原位癌和转移癌。单细胞基因组测序一是需要对基因组进行大量扩增，二是整个基因组长度固定，测序成本较高，因此有些针对全外或特定 panel 进行测序。此外，数据分析会遇到扩增不均一，allelic droupout（染色体部分区域未被扩增）等技术性噪音的干扰，因此需要对缺失数据进行推断
遗传异质性和亚克隆动力学
大部分肿瘤包含不同基因型的细胞亚群，称为亚克隆。研究表明每个肿瘤平均有超过10000个体细胞突变，其中约2-8个在驱动基因上，赋予选择优势，约30-60个蛋白质编码区变异，发生在从动基因上，可能改变其他的细胞功能。亚克隆多样性通过基因组不稳定性，同源重组缺失，染色体不稳定，染色体碎裂，APOBEC 酶活失调以及药物治疗等产生。单细胞基因组技术能够确定变异发生在相同还是不同的细胞中，从而回答亚克隆之间如何互作，哪种亚克隆能够侵袭和转移，亚克隆组成如何影响临床症状以及耐药性如何发展（是已存在的克隆还是获得新的突变）等一系列问题
对乳腺癌的单核测序发现拷贝数变化是在肿瘤进化早起短期爆发的，而点突变则是随着时间不断进化，产生更多的克隆多样性。一项针对结直肠癌的分析发现占据优势的克隆中具有典型的 APC 和 TP53 变异，但同时存在具有 CDC27 和 PABPC1 突变的罕见克隆。以上研究表明针对多种亚克隆的联合疗法可能对多克隆疾病具有较好的疗效
对接受化疗前后的乳腺癌病人样本进行单细胞基因组测序发现耐药性基因型早就存在，并被化疗选择，而同样本的 scRNA-seq 分析发现治疗前和治疗后细胞的转录组表达谱完全不同，具有耐药性的细胞在治疗前并未被发现，虽然检测到有部分细胞中表达与耐药相关的基因。以上研究表明化疗耐受性可能是通过遗传选择和新的转录程序表达共同赋予的