针对头颈癌患者的单细胞转录组分析发现肿瘤微环境中存在良性和恶性细胞，并将一种部分 EMT 状态与转移联系起来。
Introduction
单细胞组学技术的发展为我们在细胞层面探索肿瘤异质性提供了机会。上皮细胞瘤作为一种常见的癌症，对其的单细胞转录组分析尚未能深入刻画其表征。在这些肿瘤中，向引流淋巴结（局部转移）和其他器官（远端转移）的转移侵袭是发病率和死亡率的主要原因。对这些转移的治疗通常基于原位癌的分子和病理学特征，但它们是否具有相同的遗传学、表观遗传学以及缺陷我们尚不可知。原位癌以及转移癌可能存在的组成性差异使得我们无法直接比较混池测序图谱，而单细胞则为我们提供了一个很好的选择。
上皮-间叶转换（EMT）被认为是上皮细胞扩散的驱动因素。EMT 是胚胎发育的基本过程，可能被恶性上皮细胞借鉴以促进侵袭和传播。在 CTC 中已有研究证实 EMT 标志基因与疾病转移有关，但是由于大部分 EMT 研究聚焦于实验室模型，因此其在人类原位癌中的程度及意义仍存在争议。此外，虽然在某些肿瘤中鉴定出了间叶细胞亚型，但它们到底是来自于间叶癌症细胞还是肿瘤微环境总的良性间叶细胞仍不清楚。
头颈部鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）是一种异质性上皮细胞肿瘤，与长期接触酒精和烟草存在强相关性。由于病人发现时通常已经处于晚期，癌症向淋巴结（lymph node, LN）转移，因此对其的治疗仍是一个严峻的挑战。本文献中，作者对原位 HNSCC 肿瘤和对应淋巴结进行了探索研究，以更好地理解肿瘤内异质性。作者从18位患者中取了约6000个细胞进行单细胞转录组测序，从而区分出不同的恶性、基质以及免疫细胞。恶性细胞之间在细胞周期，应激，缺氧和上皮分化等程序总的表达上存在差异。其中有一组细胞呈现出部分 EMT（pEMT）的特性，但未表达经典 EMT 转录因子。这些 p-EMT 细胞位于原位癌靠近肿瘤相关纤维母细胞（CAFs）的前缘。利用上述知识，作者对 TCGA 中的混池转录组数据重新进行了分析，对 HNSCC 的各亚型有了更深入的理解，并利用 p-EMT 预测侵袭和转移等不利临床特征。
HNSCC 原位癌和转移癌的单细胞表达图谱
为了探索 HNSCC 肿瘤的细胞多样性，作者专注于 HNSCC 中最常见一种亚型——口腔癌。他们从18位从未接受过治疗的患者中提取细胞进行全长单细胞转录组测序，并从其中5位那里获取了对应淋巴结转移癌细胞进行了测序。此外，他们还进行了全外显子组测序和定向基因分型。后者能够推断出一组驱动性突变和和染色体异常，与已建立的 HNSCC 遗传学一致。
经过初步的质控，留下5902个细胞，并通过3种互补的方法区分出2215个恶性细胞和3363个良性细胞。首先，作者根据各个染色体区间的平均表达谱推断各个单细胞的大片段拷贝数变异。这些推断得到的 CNVs 与 WES 得到的结果一致，将恶性细胞与具有正常核型的非恶性细胞区分开来；第二，作者根据上皮起源将恶性细胞和肿瘤微环境中的基质细胞和免疫细胞区分开来，他们发现这些表达上皮标志基因的细胞与核型异常细胞之间存在显著一致性；最后，作者根据细胞整体的表达模式将他们初步分离，其中绝大部分与基于 CNV 和上皮标志基因分离得到的分支一致。
头颈部癌症表达异质性图谱
非恶性细胞单细胞图谱显示了 TME 的组成。作者根据表达图谱，将3363个非恶性细胞划分成8个主要的分支。根据已知的标志基因，这些分支分别为 T 细胞，B/浆细胞，巨噬细胞，树突状细胞，肥大细胞，内皮细胞，纤维母细胞以及肌细胞。值得注意的是，每个分支都包含有来自不同病人的细胞，说明 TME 中细胞类型和表达状态在 HNSCC 肿瘤之间是高度一致的，不代表病人特异性细胞亚群或批次效应，虽然各细胞组成比例不同。
通过进一步的聚类分析，作者发现 T 细胞和纤维母细胞中存在进一步的多样性。最大的 T 细胞分支（约1000个 T 细胞）可以被划分成4个亚簇，被注释为调节 T 细胞（Tregs）、传统的 CD4+ 助 T 细胞（CD4+Tconv）以及 CD8+ T 细胞和 CD8+Texhausted 两种毒性 T 细胞。毒性 T 细胞亚集之间在共抑制受体和其他与 T 细胞失能和耗竭相关的基因表达上存在差异。耗竭 CD8+ T 细胞在不同病人中所占比例存在显著差异，这些 T 细胞表达状态可能可用于理解和预测免疫检查点治疗的效果。
尽管人们对肿瘤中纤维母细胞表现出极大的兴趣，但截至目前人类肿瘤中纤维母细胞的调解状态仍未可知。约1500个纤维母细胞被分为两大一小共3个分支。其中一个表达肌成纤维细胞的经典标志基因如 α-平滑肌动蛋白（ATAC2）和肌球轻链蛋白（MYLK, MYL9）。肌成纤维细胞细胞是一种已知的 TME 成分，与创伤愈合和挛缩有关。第二个子集表达受体，配体和细胞外基质基因，包括成纤维细胞活化蛋白，平足蛋白，结缔组织生长因子等，而这些与肿瘤相关纤维母细胞有关。第三个子缺乏肌成纤维细胞和 CAFs 标志基因，可能是休眠的纤维母细胞。这些多样化的纤维母细胞表达状态在肿瘤间重复出现，可能代表 HNSCC TME 的共同特征。
虽然 CAFs 的细胞身份和起源可以归于不同的谱系，但是作者所发现的亚群与纤维母细胞高度抑制。更进一步的分析将 CAFs 分为两种类型，CAF1 和 CAF2，它们在即时早期应答基因（如 JUN, FOS），间叶细胞标志（如 VIM, THY1），配体和受体（如 FGF7, TGFBR2/3）和 ECM 蛋白（如 MMP11, CAV1）等的表达上存在差异。这种肿瘤内 CAF 异质性与 CAFs 参与 TME 中复杂结构和旁分泌交互的观点一致。
与非恶性细胞不同，恶性细胞的聚类则按照所来源的病人。超过2000中基因在各个肿瘤中差异表达，这些基因富集于各肿瘤间存在差异的 CNV 区域。其他差异则与肿瘤亚型有关，例如与解读和药物代谢相关的基因（如 GPX2, GSTMs, CYPs, ABCC1）在两种经典的肿瘤亚型中（MEEI6 和 MEEI20）中高表达。其他与应激（如 JUNB, FOSL1）或免疫活化（如 IDO1, STAT1, TNF）等相关的基因的差异表达，可能是对不同 TMEs 的应答导致。综上，本研究队列中肿瘤内恶性细胞表达异质性反映了肿瘤间遗传，亚型以及 TME 的差异。
恶性部位的肿瘤内表达异质性
接着作者聚焦于10个具有更多恶性细胞的肿瘤，探索同一肿瘤内不同恶性细胞之间表达状态的差异，通过非负矩阵分解，找出恶性细胞子集中差异共表达的基因集。例如，作者找到了 MEEI25 肿瘤内恶性细胞间差异表达的6组基因。将该方法应用于10个肿瘤，总计找出60组至少在某个肿瘤内细胞间存在差异的基因集。接着，通过层级聚类从这些基因集中提取出7组 meta-signatures，代表肿瘤之间共同表达的程序。从下图我们可以看到它们呈现出高度的相关性，表明这是不同肿瘤中都存在的常见的模式。
这7大表达程序至少在两个肿瘤的恶性细胞群中出现。其中分支1和2对应细胞周期中的 G1/S 和 G2/M 期，分支6包含 JUN，FOS 和即使早期基因，对应细胞活化和应激反应，第四个程序则包含缺氧相关基因，在缺氧条件下培养的 HNSCC 细胞中表达上升。此外，分支4和5主要包含上皮基因，例如 EPCAM，细胞角蛋白（如 KRT6, 16, 17, 75）和激肽释放酶（KLK5-11）。虽然所有恶性细胞均表达上皮基因，且当中大部分在细胞之间的表达相当一致，但是这些特定上皮基因的表达存在很大变化，可能反映了上皮分化的差异。最后，分支3包含与 ECM 相关的基因，且表达出 EMT 特征。这类程序在7个被测肿瘤中均存在。
HNSCC 中的 p-EMT 程序
虽然 EMT 程序被普遍认为可能是药物抗性，侵袭和转移等的驱动者，但对其在人类上皮肿瘤活体内的模式和显著性仍知之甚少。为此，作者检测了 EMT 特征的 ECM 程序，发现除了金属蛋白酶，层粘连蛋白，整合素等 ECM 基因，该程序还包含波形蛋白，整合素α-5等 EMT 标志。此外，该程序中分值最高的基因之一的转录生长因子-β-诱导（TGFBI），表明存在经典的 EMT 调节者 TGF-β。
虽然程序中包含典型 EMT 的关键特征，但它仍缺少其他的一些标志物。首先，虽然某些上皮基因的表达下调，但是总体而言上皮标志仍然存在；第二，作者并未发现典型 EMT 转录因子，ZEB1/2，TWIST1/2 和 SNAIL1 等的表达，只有 SNAIL2 被检测到，虽然他在肿瘤之间的程序中相关，但对同一肿瘤内的细胞之间，并不相关。最近的一些研究工作表明 SNAIL2 相较其他 EMT 转录因子，表达峰出现得更早，此外，它也参与创伤愈合的 p-EMT 应答。EMT 越来越被认为是一个连续变化的过程，因此作者假设体内试验找到的是一个部分 EMT 样状态，或者称为 p-EMT。其他的分析表明该状态与完全 EMT 程序存在差异，且与混池测序得到的间叶细胞状态也不同。
体外 p-EMT 细胞是动态的和侵略性的
作者从5个 HNSCC 细胞系中检测了 p-EMT 程序的功能特性，共计501个细胞的表达谱和人类肿瘤之间差异巨大。然而，一组来自口腔细胞系 SCC9 的细胞部分概括了 p-EMT 细胞的特征。当这些 p-EMThigh 通过流式细胞仪分离后，发现它们的侵袭性增强，而增值速率下降，与对病人的单细胞转录组分析和之前 EMT 研究的结果一致。
之前的研究表明 EMT 早期状态可能是瞬时的或者亚稳态的，因此作者考虑 p-EMT 是否是一个与大量上皮细胞群动态平衡导致的瞬时状态。为此，作者将来自 SCC9 的 p-EMThigh 和 p-EMTlow 细胞分离，培养并重新检测标志基因的表达情况。这两大细胞群在分选后4h和24h仍保持不同，但在4天后均重现出未分类前 SCC9 细胞群的标志基因分布，变得难以区分。该体外实验结果表明体内 p-EMT 可能也是一个瞬时状态。
p-EMT 细胞位于靠近 CAFs 的前沿
以上研究结果表明 p-EMT 程序是动态的，侵袭性的，且可能是对 TME 刺激的应答，这就需要我们对 HNSCC 中表达该程序的细胞的空间定位进行探索。通过免疫组化对一组 p-EMT 顶尖基因（PDPN, LAMC2, LAMB3, MMP10, TGFBI 和 ITGA5）和 HNSCC 标志基因 p63 进行染色，发现 p-EMT 标志基因染色的一组恶性细胞位于肿瘤靠近基质细胞的前沿。缺乏相关标志基因的肿瘤未被染色，而对上皮分化标志基因（SPRR1B, CLDN4）进行染色，发现这些细胞位于肿瘤的中心，与单细胞转录组数据得到的负相关结果一致。
p-EMT 细胞所处位置意味着它们可能与 TME 之间存在互作，比如配体-受体信号转导，因此作者通过某个细胞类型上所表达配体和周围另一类型细胞上表达对应受体来推断可能存在的肿瘤-基质细胞互作。该方法发现从恶性细胞向不同类型 TME 细胞传递的信号差不多，但反过来考虑传递给恶性细胞信号的情况时，发现 CAFs 必到的配体书要明显高于其他类型细胞，这当中包含了可能推动 EMT 的 TGFB3-TGFBR2, FGF7-FGFR2 和 CXCL12-CXCR7。基于上述结果，作者对肿瘤进行了 CAF 标志基因（FAP, PDPN）染色，发现 CAFs 位于靠近 p-EMT 细胞的前沿。
为了评估配体-受体互作的功能影响，作者用 TGF-β 处理 SCC9 细胞，4h后又到产生 p-EMT 样程序，且在抑制 TGF-β 后同样受到抑制。TGF-β 处理增强了侵袭性并减少增殖，抑制时则呈现出相反的效果。此外，过表达 TGFBI，一种已知的 TGF-β 靶标和顶级 p-EMT 基因，也会导致出现类似的侵袭性和增殖效果，而遗传失活该基因则会失去对 TGF-β 的应答。作者尝试对共同培养基中的原位癌的 CAFs 进行检测，却发现这些培养的纤维母细胞未能表达典型活化标志基因和配体，无法诱导共培养癌细胞的 p-EMT 应答。
综上，CAFs 和恶性细胞之间的旁分泌互作推动 HNSCC 肿瘤前沿 p-EMT 程序，可能促进了肿瘤的侵袭。
局部转移重现 HNSCC 肿瘤内异质性
为了更进一步了解潜在的决定 HNSCC 扩散的因素，作者对 LN 转移癌和原位癌进行了比较。虽然 WES 和推断得到的 CNVs 解释了一些遗传学上的差异，但它们没法找出那些普遍存在的差异，这可能是由于样本书太少的原因。
LNs 中恶性细胞的表达谱与对应原位癌的高度重叠。部分差异表达的基因在某几个 LNs-原位癌对中显著，但放到整个队列中就不是如此了。此外，p-EMThigh 和 p-EMTlow 亚群的分布在原位癌和局部转移癌之间也是比较一致的，虽然不同位点具体的比例会有所差异。这些发现表明 LN 转移所需的程序可能是动态的，因此无法通过比较原位癌和对应局部转移癌发现。事实上，之前的研究也未能够找出肿瘤和局部转移癌之间的遗传或转录差异。
此外，整体而言，LNs 中的基质和免疫细胞身份与对应原位癌中的基本一致，除了个别重要差异，例如肌细胞仅在原位癌中发现，而 B/浆细胞仅在 LNs 中发现。纤维母细胞亚群也存在差异，例如 LNs 中主要为肌成纤维母细胞和 CAF1 亚型，且倾向于表达特定配体和受体（如 IL1R1, MMP11, SPARC）。这些差异证明 LN 中信号环境发生了改变，但是 TME 仍基本维持稳定。
以上发现促使作者去检测 LN 的组织学性质，结果发现大量完整的上皮结构和“嵌在”其中的恶性细胞，表达 p-EMT 标志基因的细胞位于边缘，被 CAFs 和其他 TME 成分包围。以上发现与“共同转移”模型一致——该模型认为恶性细胞和基质细胞一起通过淋巴转移，形成淋巴结转移癌。
解析混池表达数据，重构 HNSCC 亚型
之后作者想看看从单细胞转录组数据得到的恶性和基质细胞表达程序的普遍性和预后意义。最近的一项 TCGA 研究分析了上百个 HNSCC 肿瘤，将其分为四大类：基础的，间叶细胞的，经典的和非典型的。由于 TCGA 数据来源于混池肿瘤，作者认为单个细胞成分的表达谱可以提供更多的视角，特别是希望看看这些不同的分子亚型是否反映了恶性肿瘤程序，恶性细胞组成以及 TME 组成的差异。
首先确定10个 HNSCC 肿瘤的 TCGA 表达亚型。作者对各肿瘤的恶性细胞对应的亚型表达谱进行打分，发现这些肿瘤对应3种亚型中的一种：基础的（n=7），经典的（n=2）和非典型的（n=1），没有一个肿瘤对应间叶细胞亚型，即便该亚型是口腔癌中第二常见的一种。然而，当作者将分析扩展至基质细胞和免疫细胞之后，发现有上百的 CAFs，肌成纤维母细胞和肌细胞匹配到间叶细胞亚型上。这一发现表明间叶细胞 TCGA 亚型可能是由于混池样本中基质细胞占比较高导致，而非一种不同的恶性细胞程序。事实上，针对 TCGA 样本的分析也确实发现间叶细胞亚型肿瘤中高表达 CAFs 和肌细胞特有的基因。此外，对来自 TCGA 的 HNSCC 肿瘤进行组织学分析发现间叶细胞亚型中纤维母细胞要比基础亚型多2.7倍。
为了探索 TME 成分对 TCGA 分类的影响，作者设计了一种计算方法，从 TCGA 表达谱中剔除来自非恶性细胞的影响，将分析严格限制在恶性细胞表达的基因上。由于这些基因大部分也在恶性细胞中表达，作者通过标准化其表达排除来自非恶性细胞的影响。为此，作者利用细胞特异性基因标签估算每个肿瘤内各类型细胞的相对丰度，然后针对每个基因，通过多元线性回归预测其肿瘤间混池表达量与各类型细胞中相对丰度之间的线性关系。利用该回归模型的残差，除去了细胞类型频率的干扰，包括恶性细胞比例（如纯度）以及推断的恶性细胞特异性内源表达谱。
TCGA 数据标准分析能找到4种亚型，而用上述方法则除去间叶细胞亚型，之前被判定属于间叶细胞亚型的归属于之前判定为基础的亚型（称为 malignant-basal）。综上，作者惹味 HNSCC 肿瘤分为3中恶性细胞亚型，合并后的 malignant-basal 占 TCGA 口腔癌中超过70%，约本研究中7/10的比例一致。
p-EMT 预测转移和有害的病理学特征
通过 TCGA 数据可以探索 p-EMT 程序在大队列中的流行性和意义。之前的小队列研究中，10个肿瘤中有7个的细胞存在 p-EMT 程序，恰好对应归属于 malignant-basal 亚型的7个肿瘤。在 TCGA 肿瘤中，malignant-basal 亚型的 p-EMT 水平最高。此外，对 malignant-basal 型 TCGA 肿瘤的主成分分析发现头两个成分分别是正相关的 p-EMT 基因的表达和负相关的上皮分化基因的表达，而在非典型和经典型的肿瘤中就没有这种趋势。值得注意的是，通过对混池表达数据无偏差分析得到的 p-EMT 程序与通过单细胞转录组测序得到的结果高度一致，它们相互独立地确定了除 SNAIL2 外经典 EMT 转录因子的缺失，并证明在活体内存在 p-EMT 状态。因此，通过控制来自 TME 成分的干扰，作者成功证明 p-EMT 程序表达上的差异是 HNSCC 肿瘤内异质性的主要原因。
HNSCC 淋巴扩散形成的淋巴结转移癌是疾病负荷和死亡率的主要来源。因此，对口腔癌进行切除时通常会伴随颈淋巴结切除术，除去被侵袭的第一梯队的淋巴结。具有较差预后特征的肿瘤，例如存在囊外扩增和淋巴管侵袭，同样需要堵住治疗。因此，作者希望看看体内 p-EMT 特征能否用于预测 malignant-basal 肿瘤中的不良病理学症状或疗效，结果发现高 p-EMT 分值与淋巴结转移癌的存在和数量相关，并对应更高的节结状态。此外还对应更高的肿瘤分值，从而解释了低分化肿瘤的侵略性。类似地，高 p-EMT 分值与不良病理学特征如囊外扩展和淋巴管侵袭等相关，而对于这些特征，目前还没有可靠的生物标志物。有趣的是，p-EMT 与原位癌大小无关。表明它与侵袭和转移直接相关，但与肿瘤的生长无关。
综上，p-EMT 基因位于影响这些特征的基因中的前列，其他的像细胞周期和缺氧等程序的关系就没那么紧密了，而上皮分化程序则与转移负相关，与之前发现的 p-EMT 和上皮分化之间的负相关结果一致。重要的是，p-EMT 程序相较 TCGA 间叶程序和传统的 EMT 特征，在预测节结转移和局部侵袭上表现更好。目前临床实践中用肿瘤厚度和大小等预测节结转移，导致大量不必要的颈淋巴结切除。p-EMT 能够帮助预测节结转移，减少由于非必须颈淋巴结清除术导致的死亡。
讨论
肿瘤内异质性是肿瘤学中的一大难题，单细胞转录组学的兴起促进了对发育层次，药物抗性以及免疫浸润模式等与肿瘤生物学，诊断和治疗相关的特征的识别。本文献李彤该方法对原位 HNSCC 肿瘤及对应淋巴结转移癌进行了探索，发现恶性细胞和非恶性细胞之间存在复杂的细胞生态系统，进行着活跃的细胞间交流。此外，活体内存在的 p-EMT 程序与肿瘤的转移相关。该研究有助于加深我们对上皮肿瘤内表达异质性的理解。
该研究中最重要的发现是去定了体内恶性细胞存在 p-EMT 程序。该程序设计某些间叶基因的表达上调和上皮程序的下调。虽然这会让人联想到 EMT 样程序，但它缺少经典的驱动 EMT 的转录因子，除了 SNAIL2。在单个肿瘤内的细胞之间，SNAIL2 表达量与 p-EMT 之间并无关联，但在肿瘤之间，不论是小队列还是 TCGA 大队列，两者呈现出相关性，暗示可能影响转录后调控。之前有研究发现 SNAIL2 与创伤修复所需的 EMT 样变化有关，表明侵袭性肿瘤细胞可能借鉴了该生理学应答。
考虑到缺少经典的调控程序，仍表达的上皮标志基因，以及 p-EMT 表达状态的短暂性，作者认为该程序可能是一种亚稳定状态，它浮现了 EMT 的某些特征，但又与活体外所定义的有本质上的区别。事实上，目前有越来越多的证据表明 EMT 是一个连续性的状态，而动态的 p-EMT 状态在没有失去肿瘤初始能力的情况下赋予了其侵袭性。虽然不清楚 HNSCC 中是不存在完全 EMT 状态还是状态谱仅扩展至 p-EMT，但是作者所定义的体内 p-EMT 样程序将会知道未来针对该过程的研究。
一些发现表明 p-EMT 程序可能能够推动局部侵袭和淋巴结转移。首先，免疫组化结果清楚地显示表达该程序的细胞位于原位癌的前沿，可能推动了细胞集体性地迁移。有趣的是，p-EMT 细胞与周围 TME 中的 CAFs 距离很近，与配体-受体分析结果相符，表明两者之间存在调控交流；第二，在体外实验中，p-EMThigh HNSCC 细胞呈现出更强的侵袭潜能；第三，对上百个 HNSCC 肿瘤的混池表达谱数据进行解析发现 p-EMT 是病人之间差异的重要原因，且对节结转移，淋巴管侵袭和囊外扩展有较强的预测性。另外，虽然 CAF 丰度单独并不能预测节结转移和侵袭，但同时具有高 CAF 值和高 p-EMT 值的肿瘤呈现出协同效应，具有极强的转移倾向，这可能反应了 CAFs 和恶性细胞之间存在旁分泌信号通路，推动节结疾病的发展。
其他的一些发现能调和实验的结论。首先，本研究中仅深入探索了10个肿瘤，针对更多肿瘤的分析可能会找出其他的基质，免疫和恶性细胞状态，例如进一步转向间叶细胞状态的恶性细胞；第二，p-EMT 程序在绝大部分经典型和非经典型 HNSCC 肿瘤中均不存在，但这些肿瘤的转移率与 malignant-basal 差不多。因此，p-EMT 可能与一些亚型有关，但与另一些则无关，这可能也解释了为什么 EMT 在肿瘤生物学中的重要性存在不一致的情况；第三，虽然本文中的数据揭示了 p-EMT 状态对 CAF 信号的应答，但这可能只是因为肿瘤边界破裂，TME 间交流增加的结果，因此只是与转移相关而非原因，我们需要对 p-EMT 与对应基质细胞交互是如何驱动 HNSCC 转移的进行更进一步的研究。
在一些肿瘤类型中，有通过混池数据进行亚型分类，但这并未能有效解析肿瘤内异质性。本研究中，对 HNSCC 肿瘤中恶性，基质以及免疫细胞表达状态的认知帮助我们解析 TCGA 混池数据，推断恶性细胞特异性表达谱。通过该分析发现 mesenchymal 亚型反应的是肿瘤中 TME，即 CAFs 和肌细胞的部分。没有恶性细胞被归到 TCGA 所描述的 mesenchymal 亚型，所以该亚型所展现的可能只是基质细胞的构成，因此在未来的研究中需要重新评估。相反，其他三种亚型均有足够的证据支持，来自于作者肿瘤样本的恶性细胞均只对应这些亚型中的某一种。此外，除去 TME 的干扰，这些亚型仍保持稳定。虽然如此，但是基质成分所提供的一种潜在的另一预后视角表明未来的分类系统可能需要整合肿瘤中的恶性和非恶性细胞。
总而言之，本项研究工作帮助我们深入了解了 HNSCC，以及恶性、基质和免疫细胞，对理解其他上皮癌症也会有所帮助。从混池表达数据中推断恶性细胞特异性表达谱的计算方法改善了 HNSCC 的亚型分类，提供了一种从其他癌症数据集提取信息的普适性策略。最后，本研究中所定义的 p-EMT 程序将 EMT 数据与人类肿瘤体内生物学相关联，我们需要更进一步的研究，探索该 p-EMT 程序与不良临床症状之间的连续，可能有助于指导将来的诊断和治疗。
REF
- Puram SV, et al. Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer. Cell. 2017, 171:1611-1624. doi: 10.1016/j.cell.2017.10.044.